北大谢晓亮及合作者 Cell 发表新冠病毒中和抗体研究结果，单细胞测序技术助力新冠病毒抗体研发

2023-04-20

丁香学术昨天头条解读了深圳市第三人民医院刘磊院长，中国科学院高福院士，中国科学院天津工业生物技术研究所高峰副研究员等团队联合于 5 月 13 日在 Science 杂志发表的论文：A noncompeting pair of human neutralizing antibodies block COVID-19 virus binding to its receptor ACE2。报告了 从一名康复患者中分离出的人源单克隆抗体，能有效阻断病毒与细胞受体 ACE2 结合，显示出强大的中和能力。
今天新冠抗体研发又传来喜讯，2020 年 5 月 18 日，北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）主任谢晓亮团队领衔多家合作单位在 Cell 杂志发文：Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients’ B cells。 利用高通量单细胞 RNA 和 VDJ 测序技术，从恢复期患者的抗原富集 B 细胞中快速鉴定出新冠病毒中和单克隆抗体（mAb）。在对 hACE2 转基因小鼠的感染实验中，也证实该抗体较强的治疗和预防效果。证明了通过高通量单个 B 细胞测序技术可有效地发现人源中和单克隆抗体，以应对大流行性传染病。

图片来源于 Cell

丁香学术将对本文进行详细解读，侧重单细胞技术在新冠抗体研发种的应用，并将对两个团队的结果进行简单对比。

研究内容

针对新冠病毒人源单克隆抗体的分离鉴定的方法，如单个记忆 B 细胞的克隆扩增，通常用于从异质 B 细胞群体中获得免疫球蛋白轻重链 RNA 序列，以产生单克隆抗体。但由于耗时的孵化和筛选步骤，使该技术至少需要几个月才能完成成功的筛选。而高通量单细胞测序技术的出现，则大大缩短了抗体的筛选周期，为新冠病毒以及未来大流行病的抗体疫苗研发，提供了非常重要的科学和实用价值。 与传统方法不同，通过高通量单细胞 VDJ 测序获得的大规模数据，使研究人员能够在体外抗体表达之前检查 B 细胞克隆型的富集。即，对于抗体的重链和轻链，共享相同 CDR3 区域的 B 细胞被分组为相同的克隆型，并根据克隆型观察到的细胞数量计算它们的富集。

由于被抗原激活的 B 细胞会通过克隆选择和从已经存在的幼稚型和记忆 B 细胞扩增，因此研究人员假设富集的 B 细胞克隆型更有可能产生高亲和力的新冠病毒中和抗体。通过对来自北京佑安医院的 COVID-19 恢复期患者的外周血单个核细胞（PBMCs）分离 B 细胞，并进行单细胞 RNA 和 VDJ 测序。总共分析了 6 个不同批次的 60 个恢复期患者的抗原结合 B 细胞。最终共检测出 8558 个抗原结合的 IgG1⁺ 克隆型，并鉴定出 14 个中和抗体。

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研究人员使用 ELISA 和表面等离子体共振 (SPR) 技术，对纯化的 mAbs 进行新冠病毒 RBD/S 蛋白反应性检测。鉴定出 149 个与 S 蛋白结合的 mAbs，其中一半以上的 mAbs 与 RBD 结合。 使用伪病毒系统进一步筛选所有的 ELISA 阳性单克隆抗体的中和能力时发现，只有 RBD 结合的 mAbs 表现出伪病毒中和效应，并且只有 mAbs 与 RBD 结合的解离常数 Kd 较小或接近 ACE2/RBD 的解离常数 (15.9 nM) 时，才会产生显著的中和效应。

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此外，研究人员从富集的克隆型分离出的所有中和 mAbs 中，筛选出一个最有效的抗体命名为 BD-368-2。该抗体能竞争性地抑制 ACE2 与 RBD 的结合，对伪型和真型新冠病毒的 IC50 分别为 1.2 ng/mL 和 15 ng/mL。 为了评估鉴定的中和单克隆抗体是否可以作为治疗干预和体内对新冠病毒的预防性保护，研究人员测试了抗体 BD-368-2 对感染新冠病毒的 hACE2 转基因小鼠的中和效果。研究共使用 9 只 hACE2 转基因小鼠，平均分为三组，并分别采取以下措施：
预防组，在病毒感染前 24 h 向 hACE2 转基因小鼠腹腔注射体重为 20 mg/kg 的 BD-368-2，检测预防效果。治疗组，在感染后 2 h 内注射 BD-368-2 20mg/kg。阴性对照，在感染后 2 小时注射 20 mg/kg 抗 H7N9 病毒 IgG1 抗体 HG1K。结果显示，BD-368-2 在感染前后均能大大改善感染小鼠的生理状况。此外，通过 qRT-PCR 分析感染 5 天后小鼠的肺病毒载量，发现在病毒感染前注射 BD-368-2 可以完全抑制新冠病毒。说明 BD-368-2 在体内表现出较高的治疗和预防效果。

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最后，研究人员还解析了一个中和抗体 BD-23 与新冠病毒 S 蛋白三聚体复合物的冷冻电镜结构，表明其表位与 RBD/ACE2 的结合基序重叠。此外，基于新冠病毒和 SARS-CoV 之间的高度保守性，研究人员还证明了通过抗体的 CDR3 区域，可以直接从大型抗原结合克隆型文库中选择有效的中和抗体治疗新冠病毒感染。

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综上所述，该研究的体外实验和 hACE2 转基因小鼠实验结果表明，所鉴定的中和抗体 BD-368-2 可能提供一种有效的治疗和预防解决方案。目前使用 BD-368-2 的临床试验正在进行之中。而高通量单细胞测序技术在本研究中的应用也可以扩展到新冠病毒以外的其他传染病，并可作为在未来传染性疾病大流行期间，快速发现中和单克隆抗体的技术储备。

两项结果重点指标对比

此次，高福等人分离的抗体 B38、H4 与谢晓亮等人分离的 BD-368-2 均为人源中和单克隆抗体，两家团队都是获得 nM 级别的人源中和抗体。体外实验和动物试验均表明，具有良好的治疗和预防效果。

在动物实验中，hACE2 小鼠的快速成功构建，为本次新冠病毒药物研发提供了非常重要的动物模型。高福等人使用 hACE2 转基因小鼠，在攻毒 12 小时后，以 25 mg/kg 的 B38 或 H4 单次给药。结果显示，与 PBS 对照组和 H4 组相比，B38 组小鼠在感染 3 天后体重缓慢下降并恢复。肺内病毒 RNA 拷贝数也在 3 天后明显低于 PBS 组。

谢晓亮等人使用 9 只 hACE2 转基因小鼠，平均分为三组：预防组、治疗组以及阴性对照组。以 20mg/kg 的剂量给药，在感染 5 天后检测，结果显示抗体大大改善了感染小鼠的生理状况，检测到较好的病毒治疗和预防效果。同时，预先注射抗体组，在感染病毒后，其病毒复制几乎被完全抑制。

延伸阅读

单细胞测序（Single-Cell Sequencing) 技术即从单个细胞水平上对基因组进行测序，对于识别细胞的类型、功能以及特定细胞状态的变化和变异至关重要。近年来，随着对技术的不断完善和改进，已广泛应用于神经生物学，癌症生物学、病原生物学等多个领域。众所周知，新冠病毒的出现让人们意识到病毒疫苗和抗体研发并非一蹴而就。从实验室研发到动物试验再到人体临床试验，需要一段较长的时间来验证其安全性和有效性。因此，以创新性思维开发新技术新方法，简化疫苗和抗体的制备流程将大大缩短其研发周期。此次，谢晓亮团队及其合作者运用高通量单细胞测序技术，在不到三个月的时间里就筛选到了中和抗体并进行了动物实验，让我们看到了战胜新冠病毒的曙光。同时，我们也期待在将来还有更多的新技术新思维，运用到病毒疫苗抗体或其他治疗和预防的研究中，帮助人类彻底战胜病毒。